本发明涉及一种检测细菌的方法,特别是检测肠炎致病菌的方法。所述方法包括:1)提取一个或多个细菌样本DNA;2)利用细菌16S rDNA的引物扩增样本16S rDNA全长;3)将扩增后的PCR产物进行打断;4)对来自每个细菌样本的打断后产物进行末端修复并在其3’端连接脱氧腺苷,然后连接不同的PCR-free接头;5)将以上的连接产物利用二代测序技术进行测序获得其序列;并且6)通过与已有的所有细菌的16S rDNA参考序列比对,确定每个样本中存在的细菌种类。
1.一种检测细菌的方法,包括:1)提取一个或多个细菌样本DNA;2)利用细菌16Sxa0rDNA的引物扩增样本16Sxa0rDNA全长,其中所述引物优选是:16SF:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG,16SR:TACGGYTACCTTGTTACGACTT;3)将扩增后的PCR产物进行打断,打断方式包括物理打断和/或化学打断(优选用带AFA纤维扣盖的Covaris微管在Covarisxa0S2DNA打断仪(Covaris公司)上打断);4)对来自每个细菌样本的打断后产物进行末端修复并在其3’端连接脱氧腺苷,然后连接不同的PCR-free接头;5)将以上的连接产物利用二代测序技术进行测序获得其序列,所述二代测序技术优选Illuminaxa0GA或Roche454;更优选Illuminaxa0Hiseq2000,其中测序方式可以采用Singlexa0End或Pair-End;并且6)通过与已有的所有细菌的16Sxa0rDNA参考序列比对,确定每个样本中存在的细菌种类。
2.权利要求1的方法,其中在所述步骤4)之后和所述步骤5)之前还包括纯化步骤:对4)中连接的产物进行纯化,此处纯化方式优选胶回收纯化或磁珠纯化方式;并且任选对上述回收产物进行QPCR检测。
3.权利要求1或2的方法,其中所述细菌是肠炎致病菌。
4.一种用于细菌检测的试剂盒,包括:1)提取细菌样本DNA的试剂;2)扩增细菌16Sxa0rDNA的通用引物和试剂,所述引物序列为:16SF:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG,16SR:TACGGYTACCTTGTTACGACTT;3)对PCR产物进行打断的试剂;4)PCR-free接头和接头连接的试剂,以及进行末端修复的试剂和加脱氧腺苷的试剂;以及5)进行二代测序技术测序的试剂,所述二代测序技术优选IlluminaGA或Roche454;更优选Illuminaxa0Hiseqxa02000,其中测序方式可以采用Singlexa0End或Pair-End。
5.权利要求4的试剂盒,还包括对产物进行纯化的试剂和/或对产物进行QPCR检测的试剂,此处纯化方式优选胶回收纯化,但是也可选磁珠纯化方式。
6.权利要求4或5的试剂盒,其中所述细菌是肠炎致病菌。
7.权利要求1或2的方法或权利要求4或5的试剂盒用于检测细菌的用途。
8.权利要求7的用途,其中所述细菌是肠炎致病菌。
9.权利要求7中的用途,其中所述细菌或肠炎致病菌存在于血液、大便、水、饮料、食品或化妆品中。
10.权利要求1或2的方法、权利要求4或5的试剂盒或者权利要求7的用途,其中所述细菌选自:索氏志贺氏菌(Shigellaxa0sonnei)、弗氏志贺菌(Shigellaflexneri)、鲍氏志贺菌(Shigellaxa0boydii)、伯克氏菌(Burkholderialesxa0bacterium)、多毛拟杆菌(Bacteroidesxa0capillosus)、埃氏巨球形菌(Megasphaeraxa0elsdenii)、粪链球菌(Enterococcusxa0faecalis)、致癌肠杆菌(Enterobacterxa0cancerogenus)、不动杆菌(Acinetobacterxa0sp.)、痢疾志贺菌(Shigellaxa0dysenteriae)、粘质沙雷菌(Serratiaxa0marcescens)、绿脓杆菌(Pseudomonasxa0aeruginosa)、普通拟杆菌(Bacteroidesvulgatus)、多形拟杆菌(Bacteroidesxa0thetaiotaomicron)、脆性拟杆菌(Bacteroidesxa0fragilis)和梭杆菌(Fusobacteriumxa0sp.)。技术领域
本发明属于细菌分子生物学领域,具体而言涉及细菌,尤其肠炎致病菌的检测方法。
背景技术
在肠道疾病中,尤其是炎症性肠病及肠炎,很多疾病的病因未明。研究表明,这些病因未明的肠道疾病大多与病原体的感染有一定关系,但是至今尚未找到特异病原体与某种肠道疾病有恒定关系。有研究者认为副结核分枝杆菌及麻疹病毒与炎症性肠病中的克罗恩病有关,但证据缺乏说服力。近年来,关于微生物致病性的另一种观点正日益受到重视,这一观点认为炎症性肠病是针对自身正常肠道菌群丛的异常免疫反应引起的。在炎症性肠病的动物模型中,用转基因或敲除基因方法造成免疫缺陷的炎症性肠病动物模型,在肠道无菌环境下不会发生肠道炎症,但如果重新恢复肠道正常菌丛状态,则出现肠道炎症。另在临床观察中,细菌滞留易促发克罗恩病的发生,而粪便转流能防止克罗恩病复发;抗生素或微生态制剂对某些炎症性肠病患者有益。在临床检验中,对于已明确致病菌的肠道疾病,一般可通过粪便常规检查、酶联免疫吸附试验、核酸电泳图谱分析(PAGE)、电镜或免疫学方法及必要时联合血液检测确定感染的病原体。在目前的分子诊断中,也有研究者利用16Sxa0rDNA对临床重要常见微生物进行物种分类。但是目前对16SrDNA研究方法,一般是基于Sanger法测序,芯片杂交等传统技术。临床上不明病因的肠道疾病多数与病原体感染有关,现在的病原体培养方法并不能将所有肠道内的病原体全部检测出,同时很多苛养细菌在体外不能培养。对于未知病因的肠道疾病,大多按照经验治疗,用药具有盲目性、试探性。很多药物对机体的副作用无法避免。炎症性肠病的药物治疗主要是氨基水杨酸制剂、糖皮质激素及免疫抑制剂的联合应用。症状完全好转后依然需用药一段时间,长期使用这几种药物会产生大量不良反应,例如恶心、呕吐、可逆性男性不育、糖皮质激素全身不良反应等。16Sxa0rDNA是细菌的系统分类研究中最有用和最常用的分子钟,其种类少,含量大(约占细菌RNA含量的80%),分子大小适中,存在于所有的生物中,其进化具有良好的时钟性质,在结构与功能上具有高度的保守性,素有“细菌化石”之称。由于具有约1.5Kb左右的大小,16Sxa0rDNA既能体现不同菌属之间的差异,又能利用测序技术较容易地进行序列,故容易被细菌学家和分类学家接受。利用全长16Sxa0rDNA可以对目前常见的致病菌进行分类,以达到物种水平上的区分。之前在对16Sxa0rDNA进行研究时,通常使用的是Sanger测序结合克隆的方法,或者芯片杂交方法。很多研究者已经用16Sxa0rDNA来对环境中的微生物,皮肤中的微生物进行分类研究。在目前也有利用16Sxa0rDNA或其上的某一片段(如V6区、V3区等)来对临床上重要的常见微生物进行分类研究。利用第一代测序技术Sanger法对16Sxa0rDNA研究需要结合克隆测序,这存在耗时、耗力、成本高的缺点。基因芯片技术通常被应用于基因表达水平的研究中,应用于16Sxa0rDNA的研究中同样存在成本高、无法实现高通量的缺点。以Illuminaxa0Hiseq2000为代表的二代测序技术测序通量大,成本低。在目前一个实验流程下来可以产生200G的碱基数据,平均每天产生20G的数据。高数据通量可以在测序序列数已定的情况下,使得每条序列获得高的测序深度(即测序数据总量除以目的测序基因序列长度得到的倍数),确保测序结果的可靠性。二代测序技术已经应用到微生物种属分析领域,但一般是基于16SrDNA全长10个可变区中的一个或几个(V6区、V3区等),这样在前期的PCR扩增时使用针对特定变异区的扩增引物,这样通常会造成某些种属的丢失。这种丢失一方面来自于特异变异区引物的偏好型,一方面来自于基于单一变异区进行种属分析的局限性。利用16Sxa0rDNA全长结合以IlluminaHiseq2000为代表的二代测序技术进行细菌种属分析,最大的阻碍在于测长较短,利用Pair-End测序策略也只能达到200bp的测长,由于16Sxa0rDNA在不同种属之间保守区的相似度很大这就造成了对于混合扩增的16Sxa0rDNA产物在拼接上仍然是个挑战。目前还没有利用以Illuminaxa0Hiseq2000为代表的二代测序技术进行16Sxa0rDNA全长测序应用于临床种属分类研究方面的报道。1.Altschul,S.F.,W.Gish,W.Miller,E.W.Myers,andxa0D.J.Lipman.1990.Basicxa0Localxa0Alignmentxa0Searchxa0Tool.J.Mol.Biol.215:729-731.2.Banks,J.,S.Poole,S.P.Nair,J.Lewthwaite,P.Tabona,R.McNab,M.Wilson,A.Paul,andxa0B.Henderson.2002.Streptococcusxa0sanguisxa0secretesCD14-bindingxa0proteinsxa0thatxa0stimulatexa0cytokinexa0synthesis:axa0cluexa0toxa0thepathogenesisxa0ofxa0infective(bacterial)endocarditis.Microb.Pathog.32:105-116.3.Bosshard,P.P.,S.Abels,R.Zbinden,E.C.Bottger,andxa0M.Altwegg.2003.Ribosomalxa0DNAxa0sequencingxa0forxa0identificationxa0ofxa0aerobicgram-positivexa0rodsxa0inxa0thexa0clinicalxa0laboratory(anxa018-monthxa0evaluation).J.Clin.Microbiol.41:4134-4140.4.Bottger,E.C.1989. Rapidxa0determinationxa0ofxa0bacterialribosomalxa0RNAxa0sequencesxa0byxa0directxa0sequencingxa0ofxa0enzymaticallyxa0ampl5.Edwards,U.,T.Rogall,H.Blocker,M.Emde,andxa0E.C.Bottger.1989.Isolationxa0andxa0directxa0completexa0nucleotidexa0determinationxa0ofxa0entiregenes.Characterizationxa0ofxa0axa0genexa0codingxa0forxa016Sxa0ribosomalxa0RNA.NucleicAcidsxa0Res.17:7843-7853.6.Felsenstein,J.1981.Evolutionaryxa0treesxa0fromxa0DNAxa0sequences:amaximumxa0likelihoodxa0approach.Mol.Evol.17:368-376.
发明内容
传统和常规的对细菌的确定是通过细菌分离培养、显微镜检查(光学和电子显微镜)、抗原成分检测(ELISA、免疫荧光等)、分子生物学基因诊断(核酸杂交、荧光定量PCR等)四个步骤进行的。对于及时发现、有效鉴别、快速诊断和提出预警等方面而言,目前急需一种新的检测细菌,尤其是肠炎致病菌的方法,该方法必须具备以下优点:1.无需分离培养繁复步骤,是一种检测快速、灵敏度高、检测特异性高、高通量的检测手段;2.不需要对样本分离培养,可以直接进行检测;避免人工操作的主观性带来的误差;3.同时不需荧光染料,排除了不同细菌之间交叉。本发明提供了满足以上要求的细菌检测技术。本发明提供了一种检测细菌的方法,包括:1)提取一个或多个细菌样本的DNA;2)利用细菌16Sxa0rDNA的引物扩增样本16Sxa0rDNA全长,其中所述引物优选是:16SF:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG,16SR:TACGGYTACCTTGTTACGACTT;3)将扩增后的PCR产物进行打断,打断方法可以是物理打断也可以选择化学打断,例如可以用带AFA纤维扣盖的Covaris微管在CovarisS2DNA打断仪(Covaris公司)上打断;4)对来自每个细菌样本的打断后产物进行末端修复并在其3’端连接脱氧腺苷,然后连接不同的PCR-free接头;5)将以上的连接产物利用二代测序技术进行测序获得其序列,所述二代测序技术例如是Illuminaxa0GA、Illuminaxa0Hiseqxa02000、ABI公司的SOLID测序仪、Roche的GSxa0FLXxa0Titaniumxa0System(Roche454),优选Illuminaxa0Hiseqxa02000,其中测序方式可以采用Singlexa0End或Pair-End,但不仅限于这两种测序方式;并且6)通过与已有的所有细菌的16Sxa0rDNA参考序列比对,确定每个样本中存在的细菌种类。在一个实施方案中,在上述方法的步骤4)之后和步骤5)之前还包括纯化步骤:对4)中连接的产物进行纯化,此处纯化方式优选胶回收纯化或磁珠纯化方式;并且任选对上述回收产物进行QPCR检测。本发明的方法中利用了PCR-FREE+DNA打断策略+二代测序技术的组合,这能够充分利用二代测序仪高通量、低成本特点。其中,本发明采用的二代测序技术例如是Illuminaxa0GA、Illuminaxa0Hiseqxa02000、ABI公司的SOLID测序仪、Roche的Rochexa0GSxa0FLXxa0Titaniumxa0System(Roche454),优选Illuminaxa0Hiseqxa02000,其中测序方式可以是Single-End或Pair-End,但不仅限于这两种测序方式。本发明提供了一种通过16SrDNA全长进行细菌分类的方法,通过所述方法减少了自身测序读长较短造成的限制,使二代DNA测序技术可以应用于细菌16Sxa0rDNA的测序。由于16S序列和细菌的新陈代谢密切相关,是十分重要基因,所以这段序列在细菌种内是非常保守的。在测序结果中,本发明选取能唯一比对上的序列,作为判断细菌是否存在的标准,与组装后再比对相比,这种方法简单,需要的测序深度较低,而且去除了那些保守区域的干扰。从而实现了在本发明的方法的后期的数据分析中,跳过了对序列组装这一步,直接利用测序得到的序列与所有已知的16Sxa0rDNA参考序列进行比对得到结果。相对于传统基于16Sxa0rDNA测序对细菌进行研究的方法,本发明的方法优选以Illumina的二代Hiseq2000测序平台作为技术依托,采用全长16SrDNA全长分析细菌,尤其是肠炎致病菌。本发明的方法将样本中的DNA提取经16Sxa0rDNA全长通用引物扩增并测序,可以测出所有细菌16Sxa0rDNA全长,在经过与现有数据库中细菌的16Sxa0rDNA序列比对后,便可以得到病原体的类型,继而为病原体分析和病因研究提供了准确的数据。本发明的方法可以用于分析不同样品,包括食品、饮料、水、化妆品等非临床样品,以及血液、大便等临床样品,准确确定其中含有的细菌类别等信息。在临床治疗上,确定所感染的病原体,有针对性的用药,减少了盲目、经验性用药所带来的对机体的损害。另外,本发明的方法不仅可以提供样本中具体感染的致病菌类型,在一定程度上还可以得到样本中不同病原菌的丰度信息(即不同病原体在检测物中含量的多少),为临床病理解释提供很好的参考依据,避免临床盲目对抗生素的应用,造成抗生素耐药的产生。本发明还提供了一种用于细菌检测的试剂盒,包括:1)提取细菌样本DNA的试剂;2)扩增细菌16Sxa0rDNA的引物和试剂,所述引物序列为:16SF:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG,16SR:TACGGYTACCTTGTTACGACTT;3)对PCR产物进行打断的试剂;4)PCR-free接头和接头连接的试剂,以及进行末端修复的试剂和3’端加脱氧腺苷的试剂;以及5)进行二代测序技术测序的试剂,所述二代测序技术例如是IlluminaGA、Illuminaxa0Hiseqxa02000、ABI公司的SOLID测序仪、Roche的Rochexa0GSFLXxa0Titaniumxa0System(Roche454),优选Illuminaxa0Hiseqxa02000,其中测序方式可以是Single-End或Pair-End,但不仅限于这两种测序方式。在一个实施方案中,上述的试剂盒中还包括对产物进行纯化的试剂和/或对产物进行QPCR检测的试剂,此处纯化方式优选胶回收纯化,但是也可选磁珠纯化方式。本发明还提供了上述方法或试剂盒用于检测细菌或肠炎致病菌的用途。所述细菌或肠炎致病菌优选存在于食品、饮料、水、化妆品等非临床样品,以及血液、大便等临床样品中。
附图说明
图1A显示两个样品混合DNA(6-11007105;7-1100795)打断后电泳情况(割胶前),其中泳道marker是分子量标记物(NEB-50bpxa0DNALadder),samples是割胶前样品混合DNA的电泳情况。图1B显示两个样品混合DNA(6-11007105;7-1100795)打断后电泳情况(割胶后),割胶区域为350-500bp区域。其中泳道marker是分子量标记物(NEB-50bpDNAxa0Ladder),samples是割胶后样品混合DNA的电泳情况。图2显示:该图表示在结果分析中,不同9条测序序列能够唯一比对到参考序列梭杆菌(Fusobacteriumxa0sp.)的情况。该图仅为了说明结果,为该发明的结果进行解释,本领域研究人员应理解这张结果分析图不能局限该分析方法,仅是为了简要说明该发明。
具体实施方式
本发明提供了一种检测细菌的方法,包括:1)提取一个或多个细菌样本的DNA;2)利用细菌16Sxa0rDNA的引物扩增样本16Sxa0rDNA全长,其中所述引物优选是:16SF:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG,16SR:TACGGYTACCTTGTTACGACTT;3)将扩增后的PCR产物进行打断,打断方法包括化学打断方法和物理打断方法,化学打断包括酶切,物理打断包括超声波或机械打断。4)对来自每个细菌样本的打断后产物进行末端修复并在其3’端连接脱氧腺苷,然后连接不同的PCR-free接头;5)将以上的连接产物利用二代测序技术进行测序获得其序列,所述二代测序技术例如是Illuminaxa0GA、Illuminaxa0Hiseqxa02000、ABI公司的SOLID测序仪、Roche的Rochexa0GSxa0FLXxa0Titaniumxa0System(Roche454),优选Illuminaxa0Hiseqxa02000,其中测序方式可以是Single-End或Pair-End,但不仅限于这两种测序方式;并且6)通过与已有的所有细菌的16Sxa0rDNA参考序列比对,确定每个样本中存在的细菌种类。在上述方法的步骤1)中,所述样品可以来自于环境,食品,人体或动物体等,包括食品、饮料、水、化妆品等非临床样品以及血液、大便等临床样品。提取样本DNA的方法是本领域技术人员已知的,并且容易获得的。可以使用许多市售的试剂盒,例如TakaRaxa0MiniBESTxa0Bacterialxa0GenomicDNAxa0Extractionxa0kit。任选地,还可以通过电泳确定所提取样本DNA的量的多少。在上述方法的步骤2)中,本领域技术人员可以按照常规的PCR扩增方法进行PCR扩增。对于具体的DNA扩增,本领域技术人员可以根据扩增目的核酸、引物以及其他条件选择PCR扩增条件。在上述方法的步骤3)中,所得PCR产物经过经打断。所述打断方法包括但不限于化学打断方法(例如酶切)和物理打断方法,所述物理打断方法包括超声波打断方法或机械打断方法等。在上述方法的步骤4)中,将回收的DNA片段按照二代测序仪测序文库构建的流程构建测序文库,然后进行测序,优选为采用PCR-FREE测序文库构建的流程构建测序文库,测序方法优选采用Single-End方法测序,也可选择Pair-End测序方式,测序方式的选择可以依据对结果的要求进行最优选择。PCR-Free测序文库构建的流程按照本领域技术人员已知方法构建。PCR-FREE是指将文库接头直接连接至测序文库中的DNA片段两端,在文库接头的导入过程没有PCR的参与。“PCR-Free文库接头(adapter)”是指经设计的一段碱基,其主要作用是辅助固定DNA分子在测序芯片上以及提供通用测序引物的结合位点,PCR-Free文库接头可以通过DNA连接酶将其直接连接至测序文库中的DNA片段两端,文库接头的导入过程因为没有PCR的参与,因此称作PCR-Free文库接头。“接头(adapter)”或“文库接头(libraryxa0adapter)”标签技术是指通过对多个测序文库添加不同文库接头(不同文库接头的组成序列不同,序列不同的部分称为接头标签(adapterxa0index)),构建标签测序文库,从而可实现多个不同标签测序文库混合测序,且最终各个标签测序文库的测序结果可相互区分的一种文库标签技术。可以根据常规的引物设计原则,选择PCR-Free文库接头,例如本发明实施例中使用的两条接头序列为:1:GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCGTCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG;2:GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTCGCCGTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG。本发明选择的这两条接头,仅是说明利用这两条接头可以实现本发明,但不是局限本发明。该领域研究人员应该理解只要遵循测序接头的设计原则的接头序列都可以在本发明中使用。PCR-FREE的文库构建方法的应用,可以使得整个文库构建过程中无PCR的参与,避免了在高序列相似度的PCR产物混合(pooling)文库的构建过程中由PCR引入错误而导致最后结果的准确性。在连接PCR-free接头之前进行末端修复,然后在3’端加“A”,主要是为了实现DNA片段与PCR-free接头末端的“T”利用“T-A”互补方式聚合到一起,将两者进行连接。在上述方法的步骤5)中,对回收的DNA混合物利用二代测序技术进行测序,本领域技术人员可以依照仪器的说明书进行。二代测序技术例如是Illuminaxa0GA、Illuminaxa0Hiseqxa02000、ABI公司的SOLID测序仪、Roche的Rochexa0GSxa0FLXxa0Titaniumxa0System(Roche454),优选Illuminaxa0Hiseqxa02000,其中测序方式可以是Single-End或Pair-End,但不仅限于这两种测序方式。在上述方法的步骤6)中,通过与现有细菌的16Sxa0rDNA序列进行比对,得出检测结果。序列的比对的方法是本领域技术人员已知的,也可以使用软件完成,例如Blast,短序列寡核苷酸分析软件包(SOAP,ShortOligonucleotidexa0Analysisxa0Package)。在一个实施方案中,在进行序列分析时可遵循例如以下两条原则:(1)uniquexa0read>=10,uniquexa0read:在我们测序的得到序列和参考序列的比对中,由于有部分16S序列保守性比较好,序列会比对上多个细菌的16S参考序列,不能用来有效的鉴定细菌的型别,所以我们取的则是只能比对一次的序列,就是唯一比对上的序列uniquexa0read。uniquexa0read>=10,即在一条参考序列上至少有10条只能比对到该参考序列的测序序列,我们才会判定样品中存在该参考序列代表的细菌。(2)Coverage>=60%,Coverage:根据比对结果,参考序列中有被测到的位点就叫做被覆盖位点,覆盖位点数占参考序列位点总数的百分比就是覆盖率。Coverage>=60%,即在一条参考序列上能够比对上的reads的总长占到参考序列长度的60%以上,我们判定样品中存在该参考序列代表的细菌。对与样本中细菌丰度的统计原则是:(1)统计所有和参考序列比对匹配次数小于等于5次的测序序列(reads)总数;(2)对每种细菌来说,支持的序列小于(1)中统计总数的0.1%的就是微量,大于1%就是大量,在0.1%和1%之间的就是中量。这些参数仅仅是示例性的,本领域技术人员应该理解对于不同类型的样本可以选择的不同参数。在一个实施方案中,在上述方法的步骤4)之后和步骤5)之前还包括纯化步骤:对4)中连接的产物进行纯化,此处纯化方式优选胶回收纯化或磁珠纯化方式;并且任选对上述回收产物进行QPCR检测。例如,可以将打断的DNA经2%琼脂糖电泳,割胶纯化回收350-600bpDNA条带(此范围为打断片段集中区域,大多数的打断片段长度集中在该范围)。本领域技术人员可以理解,纯化回收方法包括但不限于电泳割胶回收,也可以是磁珠回收等。优选,对回收的产物进行定量PCR(QPCR)检测,以确定回收的产物的量。本发明还提供了一种用于细菌检测的试剂盒,包括:1)提取细菌样本DNA的试剂;2)扩增细菌16Sxa0rDNA的通用引物和试剂,所述引物序列为:16SF:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG,16SR:TACGGYTACCTTGTTACGACTT;3)对PCR产物进行打断的试剂;4)PCR-free接头和接头连接的试剂,以及末端修复的试剂和3’端加脱氧腺苷的试剂;以及5)进行二代测序技术测序的试剂,所述二代测序技术例如是IlluminaGA、Illuminaxa0Hiseqxa02000、ABI公司的SOLID测序仪、Roche的Rochexa0GSxa0FLXTitaniumxa0System(Roche454),优选Illuminaxa0Hiseqxa02000,其中测序方式可以是Single-End或Pair-End,但不仅限于这两种测序方式。在一个实施方案中,上述的试剂盒中还包括对产物进行纯化的试剂和/或对产物进行QPCR检测的试剂,此处纯化方式优选胶回收纯化,但是也可选磁珠纯化方式。对于上述试剂盒,其中的提取DNA的试剂、扩增细菌16Sxa0rDNA的试剂以及对产物进行纯化的试剂可以选择本领域中常用的DNA提取试剂、DNA扩增试剂和DNA纯化试剂。QPCR检测的试剂也可以使用本领域中常用的荧光定量PCR检测试剂。对PCR产物进行打断的试剂可以根据使用的打断方法进行选择。例如化学打断方法中使用的酶等。这是本领域技术人员可以完成的。PCR-Free文库接头的选择:可以根据常规的引物设计原则,选择接头序列,例如本发明实施例中使用的两对接头序列为:1:GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCCGTCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG;2:GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTCGCCGTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG。本发明选择的这两条接头,仅是说明利用这两条接头可以实现本发明,但不是局限本发明。该领域研究人员应该理解只要遵循测序接头的设计原则的接头序列都可以在本发明中使用。PCR-Free文库接头连接至测序文库中的DNA片段两端的DNA连接酶可以是本领域中通常使用的DNA连接酶。进行二代测序技术测序的试剂可以由本领域技术人员根据具体测序技术的要求选择本领域中通常使用的试剂。实施例以下结合具体实施例对本发明进行详细地描述。如下的实施例只是示例性地对本发明进行说明,不应以任何形式理解为对本发明的限制。1.样本DNA提取获得临床肠炎病人粪便样本2份,这两份样本利用临床现有检测技术未获得阳性检测结果。该实施例选择肠炎病人样本,只是为了更好的解释该发明,而不仅仅是局限该发明。该发明提供的技术完全可以应用于环境,食品,皮肤等更广泛来源样品细菌的检测中。依照生产商提供的步骤,使用TakaRaMiniBESTxa0Bacterialxa0Genomicxa0DNAxa0Extractionxa0kit对所述两份肠炎病人粪便样本进行DNA提取,并通过电泳确定所提取样本DNA的量的多少。虽然本实施例中使用了具体的样本DNA提取方法,但本领域技术人员应理解的是,提取样本DNA并不限于所公开的方法,本领域技术人员可以选择使用任何本领域中已知的方法。2.PCR扩增和柱纯化使用16Sxa0rDNA通用引物对上述提取的样本DNA进行扩增,并对所扩增的两个样本(6-11007105;7-1100795)利用QIAquickxa0PCRxa0Purificationxa0Kit(QIAGEN公司)进行过柱纯化,以去除PCR过程中的引物二聚体、非特异的小片段产物、盐离子等。纯化后利用美国Thermo公司NanoDropND-8000微量紫外分光光度计检测OD,鉴定纯化回收率。纯化回收率:此处判断纯化回收率的标准是纯化后DNA的总量与纯化前DNA总量的百分比。3.取5ug纯化后产物加入新的1.5ml离心管,加入QIAquickxa0PCRPurificationxa0Kit中的Elutionxa0buffer使体积至100ul,把该100ul溶液加入带AFA纤维扣盖的Covaris微管在Covarisxa0Sxa02DNA打断仪(Covaris公司)上打断,打断条件如下: ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 在打断后,将所有打断产物用QIAquickxa0PCRxa0Purificationxa0Kit(QIAGEN公司)进行回收纯化,并溶于39.5ul的QIAquickxa0PCRxa0Purificationxa0Kit中的Elutionxa0buffer中。4.对所述打断产物进行末端修复。体系如下(试剂均购自Enzymatics公司): xa0xa0DNA
xa0xa037.5ul
xa0xa010×聚合酶缓冲液(B904)
xa0xa05ul
xa0xa0dNTP混合溶液(每种10mM)
xa0xa02ul
xa0xa0T4DNA聚合酶
xa0xa02.5ul
xa0xa0Klenow片段
xa0xa00.5ul
xa0xa0T4多核苷酸激酶
xa0xa02.5ul
xa0xa0总体积
xa0xa050ul
在20°C下,将以上混合物于恒温混匀仪(Thermomixer,Eppendorf公司)中孵育30分钟。然后,以QIAquickxa0PCRxa0Purificationxa0Kit(QIAGEN公司)进行回收纯化,溶于34ulxa0QIAquickxa0PCRxa0Purificationxa0Kit(QIAGEN公司)中的Elutionbuffer中。5.对上述末端修复产物3端’加脱氧腺苷。体系如下(试剂均购自Enzymatics公司): xa0xa0步骤4的末端修复产物
xa0xa032ul
xa0xa010×蓝色缓冲液(bluexa0buffer)
xa0xa05ul
xa0xa0dATP(稀释为1mM,GE公司)
xa0xa010ul
xa0xa0Klenow(3’-5’exo-)
xa0xa03ul
xa0xa0总体积
xa0xa050ul
在37°C下,将以上混合物于混匀仪(Thermomixer,Eppendorf公司)中孵育30分钟。然后,以MiniElutexa0PCRxa0Purificationxa0Kit(QIAGEN公司)回收纯化,溶于40ul的Elutionxa0buffer中。6.将上述加脱氧腺苷产物与PCR-Free文库接头(adapter)连接。加A后的产物连接Illuminaxa0PCR-Free文库接头序列(获自Illumina公司),体系如下(试剂均购自Illumina公司): xa0xa0步骤5的加脱氧腺苷产物
xa0xa038ul
xa0xa010×连接缓冲液
xa0xa05ul
xa0xa08bpxa0Indexxa0PExa0PCR-freexa0Adapterxa0oligoxa0mix(50uM)
xa0xa02ul
xa0xa0T4DNA连接酶(Rapid,L603-HC-L)
xa0xa05ul
xa0xa0总体积
xa0xa050ul
在16°C下,将以上混合物在混匀仪(Thermomixer)中连接过夜。使用Ampurexa0Beads(Beckmanxa0Coulterxa0Genomics)纯化所述连接产物,溶于32ul的QIAquickxa0PCRxa0Purificationxa0Kit中的Elutionxa0buffer中。7.将磁珠纯化后产物送荧光定量PCR(QPCR)检测。8.将以上纯化产物进行切胶回收根据Q-PCR结果,将浓度较高的样本浓度调整为与低浓度样本一致,各取15ul混合在一起,将全部产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳条件为100V,100分钟。DNAxa0marker为NEB公司的50bpxa0DNAxa0marker。割胶回收350bp-500bp长度范围的DNA片段(附图1A和1B)。胶回收产物经QIAquickxa0PCRxa0Purificationxa0Kit(QIAGEN公司)回收纯化,纯化后体积为34ul,溶于34ulxa0Elutionxa0buffer中。9.胶回收后产物进行QPCR和Agilentxa02100生物芯片分析系统进行检测,试剂和检测步骤按照Agilent公司提供的2100分析试剂盒提供的进行。10.Illuminaxa0Hiseq2000测序根据QPCR检测结果,取10pmolxa0DNA用Illuminaxa0Hiseq2000SE50程序测序,具体操作流程详见Illuminaxa0Hiseq2000操作说明书。11.上机结果分析两个样本利用Illumina二代测序技术Hiseq2000进行了检测,通过与下文表格中所列细菌的16Sxa0rDNA序列进行比对,得出检测结果。利用SOP对结果进行分析(如图2)。在结果分析时根据两条原则:(1)uniquexa0read>=10,即在一条参考序列上至少有10条只能比对到该参考序列的测序序列,我们才会判定样品中存在该参考序列代表的细菌。uniquexa0read:在我们测序的得到序列和参考序列的比对中,由于有部分16S序列保守性比较好,序列会比对上多个细菌的16S参考序列,不能用来有效的鉴定细菌的型别,所以我们取的则是只能比对一次的序列,就是唯一比对上的序列uniquexa0read。(2)Coverage>=60%,即在一条参考序列上能够比对上的reads的总长占到参考序列长度的60%以上,我们判定样品中存在该参考序列代表的细菌。Coverage:根据比对结果,参考序列中有被测到的位点就叫做被覆盖位点,覆盖位点数占参考序列位点总数的百分比就是覆盖率。对与样本中细菌丰度的统计原则是:(1)统计所有和参考序列比对匹配次数小于等于5次的测序序列(reads)总数;(2)对每种细菌来说,支持的序列小于(1)中统计总数的0.1%的就是微量,大于1%就是大量,在0.1%和1%之间的就是中量;此处参数对于具体实施例中为最优先,但对于不同的样本所选择的参数可以改变。同时在进行样本结果分析中选择了一个来自正常人便的正常样本作为对照,该正常样本在临床上无肠炎病症表现。该样本处理方式与具体实施例中两例样本处理方式一致。对已知常见致病菌的统计,结果如下: ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 从对两个样本的实验测试结果,(1)利用本发明的方法在结果分析中参照了正常样本的分析结果,以便于给出更加客观的分析。从分析结果看,某些细菌在正常人和肠炎病人样本中同时存在,但是存在含量的差异。(2)从结果看,分析得到了某些仅存在于肠炎样本中的致病菌。(3)此外,该结果给出来不同细菌在不同样本中的含量,某些致病菌在正常人样本中同样存在,如痢疾志贺菌等,但是含量较少,这可能就是为什么未导致临床表现的原因。但是在两例肠炎样本中,同时存在多种致病菌,且含量比正常人多,一定程度解释了肠炎临床致病原因。(4)该领域的研究人员应理解,针对不同来源信息的样本,在结果分析时是存在差异的。该结果仅为了更好的说明本发明,并非完全代表本发明。因此,利用Illumina二代测序技术Hiseq2000检测肠炎致病菌是可行的。在人类肠道微生物基因组研究飞速发展的今天,越来越多的肠道微生物被测序。将这一系列结果应用于临床实践是一件十分有意义的事情,从遗传物质的角度对细菌的检测,能比传统方法检测更多的微生物,结果更精确。随着技术的发展成熟,基于测序的16Sxa0rDNA检测技术很可能在不远的将来成为主流的检测方法。